Mechanizm działania izoniazydu nie jest ostatecznie poznany, prawdopodobnie hamuje syntezę kwasów nukleinowych i uszkadza otoczkę prątka. Łatwo i prawie całkowicie wchłania się z przewodu pokarmowego, po l—2 h osiąga maksymalne stężenie w surowicy krwi. Wydalany jest przez nerki (w 70%), przede wszystkim w postaci zacetylowanej, nieczynnej farmakodynamicznie, pochodnej. Izoniazyd łatwo przenika do płynów ustrojowych i tkanek. W płynie mózgowo-rdzeniowym osiąga stężenie nieznacznie mniejsze niż w surowicy krwi. Metabolizm izoniazydu jest uwarunkowany genetycznie, szybkość unieczynniania leku w wątrobie przebiega z różną szybkością. Populację ludzką można podzielić na tych, u których unieczynnianie leku występuje szybko i na tych, u których biotransformacja przebiega wolno. W celu prawidłowego ustalenia dawki należy określić stężenie leku po 6 h od chwili podania. Biologiczny okres półtrwania izoniazydu u osób z szybko przebiegającym unieczynnieniem wynosi l h, a u osób z wolno przebiegającym — 3 h. Oporność prątków na izoniazyd powstaje zazwyczaj po 6—12 tygodniach leczenia. Kojarzenie izoniazydu, np. ze streptomycyną, opóźnia powstawanie oporności prątków.